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      維生素A族化合物在調(diào)節(jié)和控制多種正常組織和上皮細(xì)胞增殖分化，生長發(fā)育，神經(jīng)系統(tǒng)功能調(diào)節(jié)，以及內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)具有重要作用。視黃醇，全反式視黃酸，9-順式視黃酸， 全反式視黃醛作為視黃醇代謝通路上的功能物質(zhì)，同時檢測這四種物質(zhì)，對生理功能研究十分重要。

     檢測方法包括以下步驟：

(1)配制目標(biāo)待測物的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液、標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液以及內(nèi)標(biāo)溶液；

(2)血液樣本經(jīng)處理后得到檢測樣本；

(3)利用HPLC-MS/MS對添加內(nèi)標(biāo)溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液進(jìn)行檢測，以目標(biāo)待測物與對 應(yīng)的同位素內(nèi)標(biāo)的色譜峰峰面積比為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液中目標(biāo)待測物的濃度為橫 坐標(biāo)，分別擬合得到目標(biāo)待測物對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，利用HPLC-MS/MS對添加內(nèi)標(biāo)溶液的 檢測樣本進(jìn)行檢測，根據(jù)對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算得到檢測樣本中目標(biāo)待測物的含量；其 中 ，HPLC-MS/MS檢測的色譜條件為：

色譜柱：ACE PFP柱(100x2.1    mm,2.6μm,);

流動相A:甲醇：乙腈：水：甲酸=300:400:300:0.1;

流動相B:甲醇：乙腈：水：甲酸=300:550:150:0.1;

Strong   wash溶液：80%甲醇；

流速0.3mL/min,柱溫為30℃,進(jìn)樣5μL;

采用梯度洗脫方式，梯度洗脫方式如下：流動相A的體積分?jǐn)?shù)+流動相B的體積分?jǐn)?shù)= 100%;其中：

0-3min流動相A的體積分?jǐn)?shù)由15%下降至0;

3-4min 流動相A的體積分?jǐn)?shù)維持在0;

4-4.1min 流動相A的體積分?jǐn)?shù)由0%上升至15%;

4.1-5min 流動相A的體積分?jǐn)?shù)維持在15%,直至5.2min停止。

一種基于HPLC-MS/MS的視黃醇，全反式視黃酸，9-順式視黃酸 和全反式視黃醛檢測方法，其特征在于：所述HPLC-MS/MS檢測的質(zhì)譜條件為：

離子源：電噴霧離子源，正離子模式；

離子噴霧電壓(IS):4500V;

離子源溫度(TEM):450℃;

離子源霧化氣(GS1):40psi;

離子源加熱輔助氣(GS2):45psi;

氣簾氣(CG):40psi;

掃描模式：MRM,MRM參數(shù)條件如下：

視黃醇：Q1,269(m/z);Q3,93(m/z);T,60(msec);DP,50(V);EP,7(V);CE,15(V);CXP, 12(V);

9-順式視黃酸：Q1,301(m/z);Q3,122.8(m/z);T,60(msec);DP,60(V);EP,10(V);CE, 20.91(V);CXP,20(V);

全反式視黃酸：Q1,301(m/z);Q3,123.1(m/z);T,60(msec);DP,60(V);EP,8(V);CE, 19.66(V);CXP,15(V);

視黃醛：Q1,285(m/z);Q3,161(m/z);T,60(m CXP,20(V);

視黃醇-d4:Q1,273(m/z);Q3,93.8(m/z);T,60(m CXP,12(V);

全反式視黃酸-d6:Q1,307.7(m/z);Q3,123(m/z);T,60(msec);DP,62(V);EP,10(V); CE,18(V);CXP,20(V)。

進(jìn)一步地，目標(biāo)待測物的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液包括視黃醇標(biāo)準(zhǔn)儲備液、全反式視黃 酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液、9-順式視黃酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液、全反式視黃醛標(biāo)準(zhǔn)儲備液，視黃醇-d4內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn) 儲備液以及全反式視黃酸-d6內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液，由目標(biāo)待測物的標(biāo)準(zhǔn)品或內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品溶解 在甲醇溶劑中配制而來，濃度均為1mg/ml。

標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液包括由W1采用空白基質(zhì)逐級稀釋得到的若干個設(shè)  計濃度梯度，所述W1由41.9uL 477.85μg/ml的視黃醇，100μL 10μg/ml的全反式視黃酸，20μ L 10μg/ml的9-順式視黃酸，20μL 10μg/ml的視黃醛溶于9818.1μL的 5 % BSA中配制而成；標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液中，視黃醇的濃度范圍為10-2000ng/ml,  全反式視黃酸的濃度范圍為0.5- 100ng/ml,9-   順式視黃酸的濃度范圍為0.1-20ng/ml, 視黃醛的濃度范圍為0.1-20ng/ml。

內(nèi)標(biāo)溶液由10μL 1mg/mL的視黃酸-d6內(nèi)標(biāo)和420μL 1mg/mL的視黃 醇-d4內(nèi)標(biāo)加入16ml甲醇中配制而成。

待測樣本的獲得方式為血液樣本置于潔凈的樣本管a 中，加入1000μL甲基叔丁基醚，充分混勻，4℃離心后吸取上清液至樣本管b中，室溫避光氮氣吹干，加入80%甲醇溶液復(fù)溶，混勻后離心，上清液即為待測樣本。

還包括質(zhì)控步驟，用來質(zhì)控的質(zhì)控品包括高濃度質(zhì)控品、中濃度質(zhì)控品 以及低濃度質(zhì)控品，高濃度質(zhì)控由800μL W1和200μL空白血清基質(zhì)混合配制而成，中濃度質(zhì) 控由100μL W1和900μL空白血清基質(zhì)混合配制而成，低濃度質(zhì)控樣品由20μL W1和1980μL空 白血清基質(zhì)混合配制而成。

高濃度質(zhì)控品中包含：濃度1600ng/mL的視黃醇，濃度80ng/mL的全 反式視黃酸，濃度16ng/mL的9-順式視黃酸，濃度16ng/mL的視黃醛；

中濃度質(zhì)控品中包含：濃度200ng/mL的視黃醇，濃度10ng/mL的全反式視黃酸，濃 度2ng/mL的9-順式視黃酸，濃度2ng/mL的視黃醛；

低濃度質(zhì)控品中包含：濃度40ng/mL的視黃醇，濃度2ng/mL的全反式視黃酸，濃度 0.4ng/mL的9-順式視黃酸，濃度0.4ng/mL的視黃醛。

      基于HPLC-MS/MS 的高靈敏度，高特異性，對視黃醇，全反式視黃酸，9-順式視黃  酸，全反式視黃醛進(jìn)行檢測，通過前處理和質(zhì)譜方法的同時優(yōu)化將濃度差異巨大的視黃醇， 全反式視黃酸，9-順式視黃酸，全反式視黃醛一針進(jìn)樣就可出結(jié)果，該方法時長只需 5.2min, 對于大樣本量的實驗，節(jié)約了時間。