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NAD是一種傳遞電子的生物學(xué)物質(zhì)，是氧化型輔酶Ⅰ。它的體內(nèi)有很多脫氫酶，能夠連接三羧酸循環(huán)和呼吸鏈。將代謝過程中脫下來的氫傳遞給黃素蛋白，還原形式是NADH。NAD是脫氫酶的輔酶，如乙醇脫氫酶，用于氧化乙醇。NAD在糖酵解，糖異生，三羧酸循環(huán)和呼吸鏈中發(fā)揮著不可替代的作用。中間產(chǎn)物將脫下的氫傳遞給NAD，使之成為NADH。

檢測NAD的含量，一般采用競爭抑制酶聯(lián)免疫（ELISA）法來測定待測樣本的含量。

這種方法的原理是：將煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗體的微孔中同時加入生物素標(biāo)記的抗體和待測樣本或標(biāo)準(zhǔn)品。溫浴后，經(jīng)洗滌后，加入HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過溫育和徹底洗滌加入底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化為藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化為黃色。顯色的程度和樣本濃度成正相關(guān)，通過標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋的方式，酶標(biāo)儀450nm波長處，測定吸光度值，并繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣本測定值，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出樣品中NAD含量。

檢測流程：

實(shí)驗(yàn)之前，一定要準(zhǔn)備好標(biāo)準(zhǔn)品，試劑和樣品。如果是試劑盒的話，就要先看清楚說明書的要求。加樣，加樣的時候需要認(rèn)真的。比如，要加50ul的樣本或標(biāo)準(zhǔn)品，需要校準(zhǔn)移液器，確保數(shù)據(jù)沒有大的偏差。有的試劑，在使用前是要現(xiàn)場配制的。加樣后在37℃溫浴1h，這個時候就要注意了，酶標(biāo)板中的溶液接受溫度會有一點(diǎn)延遲。也就是剛放進(jìn)去開始計(jì)時，到1個小時拿出來，溶液的受熱時間未必是1個小時。洗板3次，確保洗滌徹底，無殘留。加入檢測溶液100ul，37℃孵育30min，洗板5次。加入TMB底物90ul，37℃孵育10-20min，加終止液50ul，在450nm波長處讀數(shù)。這個時候，要盡快的讀數(shù)，不要等太長時間，數(shù)據(jù)又容易出現(xiàn)偏差。