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木聚糖酶活性測定方法
來源: | 作者:上海優(yōu)選生物 | 發(fā)布時間: 2024-05-14 | 323 次瀏覽 | 分享到:

木聚糖是一種存在于植物細胞壁中的多糖類物質(zhì),是植物半纖維素的主要成分。木聚糖的結(jié)構(gòu)是復雜的,而且具有高度分枝。如果要降解木聚糖,就需要一組相對復雜的酶,通過相互配合的方式,共同來降解掉木聚糖。它主要包括β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶、外切β -1,4- 木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-D-葡糖苷酸酶、乙?;揪厶敲负头铀狨ッ?,可降解自然界中大量存在的木聚糖類半纖維素。還有很多種類的酶,還沒有被發(fā)現(xiàn),需要進一步的探索。木聚糖酶分布廣泛,可以從動物、植物及微生物體內(nèi)獲得。現(xiàn)在,木聚糖酶已應用在釀造、飼料工業(yè)生產(chǎn)中。常用的檢測方法有分光光度法,高效液相色譜法等。



檢測原理:木聚糖酶可以將底物木聚糖降解為寡糖和單糖,具有還原性的寡糖和單糖在沸水浴的條件下,能夠和DNS試劑發(fā)生顯色反應。通過反應溶液的顏色的變化,來確定還原糖的含量。因為還原糖的生成量和反應液的木聚糖活力是成正比的,通過分光光度法可以測定,計算出樣品中的木聚糖酶活力。


檢測所用的試劑有:乙酸溶液、乙酸鈉溶液、氫氧化鈉溶液、乙酸-乙酸鈉緩沖溶液、木糖溶液、木聚糖溶液、DNS試劑。所需要的儀器設(shè)備有:碾缽、分樣篩、分析天平、pH計、磁力攪拌器、電磁振蕩器、離心機、恒溫水浴鍋、分光光度計等。



標準曲線:吸取乙酸-乙酸鈉緩沖溶液4ml,加入DNS試劑5ml,沸水浴加熱5min,用自來水冷卻至室溫,用水定容至25ml,制成標準空白樣。分別吸取木糖溶液1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml,加入緩沖溶液定容至100ml,配制成0.1-0.7mg/ml的木糖標準溶液。按照上述的標準溶液配制,分別做2次平行。吸取木糖標準溶液2ml,分別加入2ml水和5mlDNS試劑。電磁振蕩3s,沸水加熱5min,用自來水冷卻至室溫,用水定容至25ml。以標準空白樣作為對照,在540nm處測吸光度OD值。以木糖濃度為Y軸,吸光度OD值為X軸,繪制標準曲線。


檢測過程:吸取10ml木聚糖溶液,37℃平衡10min。吸取10ml經(jīng)過稀釋的木聚糖酶溶液,37℃平衡10min。吸取2ml平衡過的木聚糖酶液,加入5mlDNS試劑,電磁振蕩3s。加入2ml木聚糖溶液,37℃保溫30min。沸水浴加熱5min,用自來水冷卻至室溫,加水定容至25ml,電磁振蕩3s。以標準空白樣為空白對照,在540nm處測定吸光度。以同樣的方法,加入2ml的木聚糖酶,電磁振蕩3s,37℃精確保溫30min,加入5mlDNS試劑,電磁震蕩3s,以終止酶解反應。沸水浴加熱5min,用自來水冷卻至室溫,加水定容至25ml,振蕩3s,以標準空白樣為空白對照,在540nm處測定吸光度。


計算結(jié)果:根據(jù)反應前后的吸光度值差以及標準曲線的相關(guān)系數(shù),計算出樣品中的木聚糖酶活。


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